Электрофорез и хроматография — Методы исследования в клинической биохимии

Двумерный электрофорез

  • Электрофорез двумерный — способ разделения сложных смесей белков, в котором сочетаются электрофорез белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и изоэлектрическое фокусирование. Этот метод увеличивает разрешение одномерного гель-электрофореза, а также позволяет исследовать неканонические структуры, возникающие в сверхспирализованной молекуле кольцевой ДНК. Оценить размер молекул помогут маркеры молекулярных масс. Последующая детекция на гельдокументирующих системах позволит визуализировать результат.

Реактивы для горизонтального электрофореза: агарозы, маркеры длин фрагментов ДНК, красители интеркалирующие для визуализации НК, красители для нанесения образцов на гель, буферы для электрофореза нуклеиновых кислот.

Готовые полиакриламидные гели удобны в применении, разработаны под различное количество образцов (от 1 до 26 лунок) и адаптированы к различным по размеру электрофорезным камерам. Готовые стрипы для двумерного электрофореза доступны в широком спектре диапазонов pH, длиной от 7 до 24 см.

Для автоматического препаративного электрофореза — при отделении необходимого фрагмента автоматически — используются системы препаративного электрофореза для разделения и выделения ДНК/РНК/белков серии Pippin, производства Sage Science.

Другие типы электрофореза: вертикальный, горизонтальный, капиллярный, капиллярный на чипе.

Связанные понятия

Дот-блот — техника, используемая в молекулярной биологии для детекции различных макромолекул, таких как нуклеиновые кислоты или белки. Данная техника является некоторым упрощением вестерн-блота: образцы, содержащие исследуемые макромолекулы наносятся сразу на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану, минуя стадию предварительного электрофореза в ПААГ (в частности при работе с белками).

Тканевая матрица (ТМА, tissue microarray, тканевой мастер-блок, множественно-тканный парафиновый блок ) — в медицине, парафиновый блок-реципиент в который встроены множественные тканевые цилиндры, извлеченные из стандартных парафиновых блоков-доноров и организованные в виде упорядоченной последовательности (матрицы). ТМА позволяют сохранять и использовать ценные тканевые ресурсы более эффективно и экономично для гистохимического, иммуногистохимического (ИГХ) и молекулярного исследований.

Читайте также:  Стресс, сахар и еще 12 неожиданных причин повышения холестерина в крови

MTT-тест — колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. НАДФ-H-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты могут, при определенных условиях, отражать количество жизнеспособных клеток. Эти ферменты способны восстанавливать тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид в нерастворимый формазан, который имеет пурпурное окрашивание. Другие близкородственные тетразолиевые красители: XTT, MTS и WST, которые используются в связи с промежуточным.

Методы изучения клетки

Методы изучения клетки

  1. Оптическая микроскопия (увеличение – 8 000 раз, минимальный размер объекта – 0,2 мкм).
  2. Электронная микроскопия (увеличение – 100 000 раз, толщина препаратов не больше 500 х 10-8 см).
  3. Туннельная микроскопия – алмазная игла сканирует препарат. В момент перекрывания электронных облаков иглы и молекул препарата компьютер регистрирует скачок электрического тока. После анализа полученных данных компьютер строит изображение на экране дисплея (разрешение – отдельные атомы).
  4. Флуоресцентная микроскопия – для изучения микроструктур клетки используют специальные флуоресцентные красители и флуоресцентный микроскоп.
  5. Сканирующая микроскопия – использование сканирующего электронного микроскопа для получения объёмных изображений клетки.
  6. Фазово-контрастная микроскопия – получение изображений прозрачных объектов с помощью оптического микроскопа за счет сдвига фаз электромагнитных волн.
  7. Интерференционная микроскопия – наблюдение неокрашенных прозрачных структур и вычисление их сухой массы.
  8. Химические методы.
  9. Центрифугирование – разделение частей клеток, отличающихся по удельному весу, с помощью центрифуги; выделение разных компонентов клетки и их исследование.
  10. Хроматография – метод, основанный на разной скорости движения через адсорбент растворенных в специальном растворе веществ; при пропускании такого раствора через адсорбент каждое вещество из смеси передвигается на определенное расстояние в зависимости от своей молекулярной массы (в качестве адсорбента используют волокна фильтровальной бумаги, порошок целлюлозы и др.).
  11. Электрофорез в геле – разделение смеси веществ в растворе с помощью электрического тока.
  12. Метод меченных атомов – введение радиоактивного изотопа какого-либо химического элемента в состав вещества для того, чтобы проследить путь его превращений в клетке.
  13. Метод культуры клеток и тканей – изучение живых клеток под микроскопом вне организма (рост, размножение, выделение факторов роста, получение клеточных гибридов и др.).
  14. Метод рекомбинантных ДНК – изучение тонких механизмов клеточных процессов, функций генов путем встраивания ДНК исследуемых объектов в генетический аппарат бактерий или вирусов (генная биоинженерия).
  15. Методы нанобиотехнологии.
Читайте также:  Ученые рассказали о влиянии алкоголя на развитие рака Новости Известия

Кириленко А. А. Биология. ЕГЭ. Раздел «Молекулярная биология». Теория, тренировочные задания. 2017.

Метод электрофореза в молекулярной биологии

Принципы гель-электрофореза

Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.

Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.

Как это работает?

Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.

Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.

Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.

Читайте также:  На какой день можно сдавать кровь на хгч

Трансиллюминатор

После завершения разделения гель окрашивается красителем, чтобы выявить полосы разделения. Бромид этидия представляет собой флуоресцентный краситель, обычно используемый в гелевом электрофорезе. Гель вымачивают в разбавленном растворе бромида этидия и затем помещают на УФ-трансиллюминатор для визуализации разделительных полос.

Полосы сразу проверяются или фотографируются для дальнейшего использования, поскольку они будут диффундировать в гель с течением времени. Краситель также может быть загружен в гель заранее, чтобы отслеживать миграцию молекул, как это происходит.

Применение гель-электрофореза

Гель-электрофорез широко используется в лабораториях молекулярной биологии и биохимии в таких областях, как судебная медицина, консервативная биология и медицина.

Ниже перечислены некоторые ключевые применения технологии:

  • При отделении фрагментов ДНК для отпечатков пальцев ДНК для расследования преступлений
  • Проанализировать результаты полимеразной цепной реакции
  • Проанализировать гены, связанные с определенной болезнью
  • В профилировании ДНК для проведения таксономических исследований для различения различных видов
  • При тестировании отцовства с использованием отпечатков пальцев ДНК
  • При изучении структуры и функции белков
  • При анализе устойчивости к антибиотикам
  • В методах блоттинга для анализа макромолекул
  • Изучая эволюционные отношения, анализируя генетическое сходство между популяциями или видами

Добавить комментарий Отменить ответ

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте как обрабатываются ваши данные комментариев.

Ссылка на основную публикацию
ЭКГ в Северном Бутово — Москва
ЭКГ в Бутово К огромному сожалению, количество населения, страдающего различными сердечно-сосудистыми заболеваниями, непрерывно возрастает. Этому способствуют постоянные стрессы, переутомления, неблагоприятная...
Шишка на лице под кожей причины появления, способы избавления
Наросты на коже: доброкачественные, злокачественные и пограничные Кожные новообразования являются результатом интенсивного деления клеток эпидермиса и по своей природе бывают...
Шишка на ноге причины появления, тревожные симптомы и методы лечения
Если растёт косточка на ноге Почему растет косточка на ноге и как с этим бороться Косточка на ногах – основной...
ЭКГ при инфаркте миокарда фото пленок и расшифровка признаков
Виден ли инфаркт на кардиограмме Диагностика ишемической болезни сердца (ИБС) – жалобах (симптомах заболевания), – истории развития Вашего заболевания, –...
Adblock detector